DHE-RP,超氧化物特異性探針

一、DHE-RP超氧化物熒光探針屬性：
化學屬性：該探針為有機熒光小分子，分子結構含可被 O2??特異性攻擊的脫氫位點，同時帶有核酸結合基團（如插嵌基團或靜電結合基團），未激活時熒光量子產率極低，呈 “熒光淬滅” 狀態。
特異性優勢：與常規活性氧探針不同，其識別位點僅對 O2??的電子轉移特性敏感，對?OH 的強氧化性、1O2的親電加成特性均無直接響應，可有效排除兩種活性氧的檢測干擾。
熒光性能：未被激活時無明顯熒光；經 O2??脫氫并與核酸結合后，發射紅色熒光，激發波長與發射波長通常分別約為518nm和606 nm（具體數值隨實驗體系（如 pH、溶劑）略有波動，建議以實際測試為準）。

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二、反應原理：
1. O2?-介導的脫氫反應（激活關鍵）
探針分子中的活性氫供體基團（如酚羥基、氨基取代的烯丙基等）為 O2?-的特異性作用位點。O2?-作為弱氧化劑，通過電子轉移方式奪取該位點的活性氫，使探針分子發生氧化脫氫，生成具有共軛雙鍵的活性中間體。此過程為不可逆反應，且僅能由 O2?-觸發，?OH、1O2無法實現該脫氫機制。
2.與核酸結合并產生紅色熒光
脫氫后的活性中間體因共軛體系擴展，具備了與核酸（DNA/RNA）結合的結構基礎，主要通過插嵌作用（嵌入核酸雙鏈的堿基對之間）或靜電相互作用（與核酸磷酸骨架結合）與核酸結合。結合后，探針分子的分子構象趨于穩定，熒光量子產率大幅提升，最終在特定激發光下發射紅色熒光，熒光強度與體系中 O2?-的濃度呈正相關（在一定濃度范圍內）。

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熒光光譜

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三、通用實驗方法（細胞外 / 細胞內檢測）
以下為該 DHE-RP 常規實驗操作流程，可根據研究場景（如體外體系、細胞模型）調整參數，核心需控制探針濃度、孵育時間及活性氧干擾。
1.實驗前準備
試劑配制
探針儲備液：取適量 DHE-RP 粉末，用DMSO溶解，配制成 10~20 mM 的儲備液，分裝后于 - 20℃避光保存，有效期 6 個月（避免反復凍融）。
探針工作液：實驗前用緩沖液（如 PBS、HEPES，pH 7.2~7.4）將儲備液稀釋至5~20 μM，現配現用，全程避光。
陽性對照：超氧陰離子發生劑（如黃嘌呤 - 黃嘌呤氧化酶體系，X/XOD）；陰性對照：超氧陰離子清除劑（如超氧化物歧化酶，SOD，200~500 U/mL）。
實驗材料：緩沖液（PBS/HEPES）、熒光酶標儀 / 激光共聚焦顯微鏡、離心管 / 96 孔板 / 細胞培養皿、移液槍（避光吸頭）。
方法 1：細胞外體系 O???檢測（96 孔板法，熒光酶標儀）
適用于體外溶液中 O???的定量檢測，如酶促反應體系、藥物誘導的自由基生成體系。
向 96 孔黑色避光板中加入反應緩沖液（如 PBS），每孔 80 μL。
加入探針工作液，每孔 10 μL，輕輕吹打混勻，室溫避光孵育 5 min。
加入待檢測樣品（或陽性 / 陰性對照），每孔 10 μL，使體系終體積為 100 μL，探針終濃度為 0.5~2 μM。
室溫避光孵育15~30 min，用熒光酶標儀檢測熒光信號：激發波長設為 518~570 nm，發射波長設為 580~620 nm，記錄每孔的相對熒光強度（RFU）。
數據處理：以陰性對照孔的熒光強度為基線，計算樣品孔的相對熒光值，結合標準曲線（若需定量）確定 O???濃度。
方法 2：細胞內 O???檢測（激光共聚焦顯微鏡法）
適用于活細胞內 O???的定位與定性檢測，需保證細胞活性，全程避光操作。
細胞培養：將對數生長期的細胞接種于共聚焦培養皿中，密度為 5×10?~1×10?個 / 皿，置于 37℃、5% CO?培養箱中培養 24 h，使細胞貼壁。
探針孵育：吸除培養基，用預溫的 PBS 輕輕洗滌細胞 2 次，加入含5~10 μM探針工作液的無血清培養基，37℃、5% CO?培養箱中避光孵育20~40 min。
洗滌：吸除探針培養基，用預溫的 PBS 洗滌細胞 3 次，每次 5 min，洗去未進入細胞的游離探針。
加樣處理：加入含待檢測刺激物（或陽性 / 陰性對照）的無血清培養基，繼續孵育指定時間（如 10~60 min，根據刺激物起效時間調整）。
熒光成像：將培養皿置于激光共聚焦顯微鏡下，選擇合適的激發光（518~570 nm），采集發射光（580~620 nm）的熒光圖像，觀察細胞內紅色熒光的分布與強度。
對照設置：
空白對照：僅加細胞和無血清培養基，不加探針；
陰性對照：細胞孵育探針后，加入 SOD（終濃度 200 U/mL）再加入刺激物；
陽性對照：細胞孵育探針后，加入 X/XOD 體系（黃嘌呤終濃度 0.1 mM，黃嘌呤氧化酶終濃度 0.01 U/mL）。

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