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      瓊脂糖凝膠回收DNA的常用方法

      Release Time:2022-09-30

      一、瓊脂糖凝膠回收DNA的常用方法
      1. 透析袋法
      使用透析袋提取瓊脂糖凝膠是一種電洗脫過程。它涉及通過施加電流洗脫 DNA。原理是電場導致 DNA 條帶遷移出凝膠。 DNA 片段將被捕獲到透析膜中。首先,您需要將凝膠片在 -20°C 下冷凍 30 分鐘,以便于處理。
      實驗的步驟
      ※ 將5cm的透析袋剪開,開水活化10分鐘。激活后,用蒸餾水內外沖洗,然后用 0.5 × TBE 緩沖液沖洗。用透析夾密封透析袋的一端,并將冷凍凝膠插入管內。
      ※ 加入 200-400 µl,0.5 × TBE 緩沖液,并用第二個透析管密封管的另一端。之后,將透析袋浸入裝有電泳緩沖液的電泳槽中。DNA 條帶應與電極平行并施加 5 V/cm 或 100 V 的電場。
      ※  可以使用紫外燈跟蹤 DNA 遷移。 DNA 從凝膠中遷移出來需要 10-15 分鐘。遷移的 DNA 將向正端粘附在透析膜上。它會留在里面,但不會移出透析袋。
      ※  輕輕反轉電流方向,將 DNA 從透析膜上敲下來。之后,從管中收集緩沖液并使用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀提取 DNA。將沉淀的 DNA 溶解在適當體積 (10 µl) 的 TE 緩沖液或水中。
      ※  DNA 沉淀量很小,可能看不到。最終純化的樣品可以很容易地用于下游應用。雖然這似乎是一個簡單的過程,但使用透析袋提取瓊脂糖凝膠并不是那么容易的協議。該方案比較耗時,且仍然涉及苯酚/氯仿萃取,然后是乙醇沉淀。
      2. DEAE-纖維膜片法
      ※ 使用 DEAE 纖維素膜進行瓊脂糖凝膠提取是電洗脫和旋轉柱的組合。在此過程中,使用手術刀片在所需 DNA 片段帶的正下方制作一個狹縫。但不要取下帶子,只需在它下面開一個口子。之后,剪下一小塊尺寸為 3 mm x 10 mm(與狹縫尺寸相同)的 DEAE 纖維素紙。
      ※ 將紙插入狹縫中,然后將凝膠返回到電泳槽中。運行電泳 2-5 分鐘。在電泳過程中,DNA 會遷移出條帶并粘附在濾紙上。使用離心柱將 DNA 從紙條中洗脫出來。在此過程中可以使用紫外燈,以確保 DNA 已粘附在紙上。用針從內向外在 500 µl 微量離心管底部的中心創建一個小孔。
      3.  DEAE-纖維素膜電泳
      從凝膠中取出膜并將其(DNA 面朝下)放入 500 µl 微量離心管中。將 500 µl 試管放入 1.5 ml 離心管中。在 500 µl 試管中加入 100 µl TE 緩沖液,并以 5,000-10,000 rpm 的轉速旋轉試管 30 秒。離心后,DNA 將被洗脫到收集管 (1.5 ml) 中。繼續進行苯酚/氯仿提取協議,然后進行乙醇沉淀。這些后續步驟濃縮回收的 DNA,DNA 樣品可以重新懸浮在約 10 µl 的 TE 緩沖液中。
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