熒光顯微鏡的一個(gè)基本原理是在熒光劑的幫助下對(duì)細(xì)胞成分進(jìn)行高度特異性的可視化。這可以是一種熒光蛋白——例如 GFP——在基因上與感興趣的蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)。如果克隆是不可能的——例如在組織學(xué)樣本中——使用免疫熒光染色等技術(shù)來可視化感興趣的蛋白質(zhì)。為此，使用了與不同熒光染料連接并直接或間接與適當(dāng)目標(biāo)結(jié)構(gòu)結(jié)合的抗體。在熒光染料的幫助下，熒光顯微鏡不僅限于蛋白質(zhì)，還可用于檢測(cè)核酸、聚糖和其他結(jié)構(gòu)。甚至可以使用特定應(yīng)用的各種活細(xì)胞染料，這些染料允許使用細(xì)胞器選擇性染色（例如 ER、線粒體、高爾基體）或功能測(cè)定（例如，例如活細(xì)胞追蹤、標(biāo)記、細(xì)胞增殖或活死細(xì)胞測(cè)定，其中熒光是讀出方式。甚至可以檢測(cè)到鈣離子等非生物物質(zhì)。本文介紹了常用的熒光劑。

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免疫熒光
在熒光顯微鏡中，有兩種方法可以顯示您感興趣的蛋白質(zhì)。要么借助內(nèi)在熒光信號(hào)——通過將熒光蛋白與靶蛋白進(jìn)行基因連接——要么借助與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。對(duì)于一些生物學(xué)問題，執(zhí)行后一個(gè)問題更有用甚至是必要的。例如，在組織學(xué)樣本的情況下，不可能使用熒光蛋白，因?yàn)橥ǔ颖緛碜圆缓腥魏螣晒獾鞍椎纳矬w。此外，如果有功能性抗體可用，免疫熒光比熒光蛋白技術(shù)快得多，在熒光蛋白技術(shù)中，您必須克隆感興趣的基因并將 DNA 轉(zhuǎn)染到足夠的細(xì)胞中。熒光蛋白的另一個(gè)缺點(diǎn)在于它們本身就是蛋白質(zhì)的性質(zhì)。有了它，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)具有特定的蛋白質(zhì)特征，這可能導(dǎo)致功能障礙或?qū)λ街母信d趣蛋白質(zhì)的誤解。然而，應(yīng)該考慮使用熒光蛋白通常是研究活細(xì)胞的首選方法。
免疫熒光利用抗體對(duì)其抗原的非常特異性的結(jié)合親和力。這可以有兩種不同的外觀。最簡(jiǎn)單的方法是使用一種與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。這稱為直接免疫熒光。
在大多數(shù)情況下，使用兩種形式的抗體。第一個(gè)與目標(biāo)蛋白結(jié)合，本身沒有熒光標(biāo)記（一抗）。但是與一抗結(jié)合的第二種抗體（二抗）特異性地?cái)y帶熒光染料。這種方法稱為間接免疫熒光，具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。一方面存在放大效應(yīng)，因?yàn)椴恢挂环N二抗與一種一抗結(jié)合。另一方面，通常比用普通熒光染料標(biāo)記的特異性一抗更容易找到二抗。下面，我們回顧一下最常用的熒光染料。

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FITC 和 TRITC
異硫氰酸熒光素 (FITC) 是一種有機(jī)熒光染料，可能是免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)中最常用的染料之一。 它在 495/517 nm 處有一個(gè)激發(fā)/發(fā)射峰，并且可以借助其與蛋白質(zhì)上的氨基、巰基、咪唑基、酪氨酰基或羰基結(jié)合的反應(yīng)性異硫氰酸酯基團(tuán)與不同的抗體偶聯(lián)。 FITC（是最早用于熒光顯微術(shù)的染料之一，也是 Alexa Fluor®488 等其他熒光染料的前體。它的熒光活性是由于其大的共軛芳族電子系統(tǒng)，可被藍(lán)色光激發(fā) 光譜。

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1.果蠅胚胎發(fā)育，綠色：FITC，紅色：TRITC。
一種經(jīng)常與 FITC 結(jié)合使用的染料是 TRITC（四甲基羅丹明-5-（和 6）-異硫氰酸酯）。 與 FITC 不同，TRITC 不是熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。 羅丹明也有一個(gè)大的共軛芳香電子系統(tǒng)，這導(dǎo)致了它們的熒光行為。 TRITC 被綠色光譜中的光激發(fā)，最大波長(zhǎng)為 550 nm。 其發(fā)射最大值位于 573 nm。 與蛋白質(zhì)（例如抗體）的結(jié)合也基于反應(yīng)性異硫氰酸酯基團(tuán)。
盡管 FITC 和 TRITC 仍被廣泛使用，但它們是相當(dāng)弱的熒光染料，不推薦用于最先進(jìn)的顯微鏡檢查。

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花青染料
Alexa Fluor® 染料是一大類帶負(fù)電荷的親水性熒光染料，常用于熒光顯微術(shù)。 所有 Alexa Fluor® 染料都是不同堿性熒光物質(zhì)的磺化形式，如熒光素、香豆素、花青或羅丹明（例如 Alexa Fluor®546、Alexa Fluor®633）。 在它們的標(biāo)簽中提到了各自的激光激發(fā)波長(zhǎng)。 例如，最常用的染料之一 Alexa Fluor®488 的最大激發(fā)波長(zhǎng)為 493 nm，允許使用標(biāo)準(zhǔn) 488 nm 激光進(jìn)行激發(fā)，而 Alexa Fluor®488 的最大發(fā)射波長(zhǎng)為 519 nm，它是一種熒光素衍生物和 具有與 FITC 相似的特性。 然而，它顯示出更好的穩(wěn)定性、亮度和更低的 pH 敏感性。

2. 小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎，中間體，E10.5小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎的五個(gè)中間體：EpaxisMyf5 eGFP； 對(duì) GFP-Alexa 488 進(jìn)行免疫染色； 胚胎肌纖維用 Desmin-Cy3 染色，細(xì)胞核從上到下顯示為 Hoechst 尺寸：3.5 mm (a), 800 µm (b)。 禮貌：Aurélie Jory, Cellules Souches et Développement, Institut Pasteur, Paris, France 和 IGBMC, IGBMC 影像中心

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3.小鼠成纖維細(xì)胞，綠色：F-Actin，F(xiàn)ITC，紅色：Tubulin，Cy5，藍(lán)色：Nuclei，DAPI。

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DNA染色
您可能想使用熒光顯微鏡研究核酸。例如，通過檢測(cè)細(xì)胞核來定義細(xì)胞的確切位置或數(shù)量。最常見的 DNA 染色劑之一是 DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole），它與 DNA 雙螺旋的富含 A-T 的區(qū)域結(jié)合。與未結(jié)合狀態(tài)相比，如果連接到 DNA 上，DAPI 熒光強(qiáng)度會(huì)增加。它被最大波長(zhǎng)為 358 nm 的紫外光激發(fā)。發(fā)射光譜很寬，峰值在 461 nm。對(duì)于 RNA 結(jié)合，也可以檢測(cè)到微弱的熒光。在這種情況下，發(fā)射移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能夠滲透完整的質(zhì)膜，使其對(duì)固定細(xì)胞和活細(xì)胞有用。
第二種廣泛使用的 DNA 染色選項(xiàng)是 Hoechst 染料系列。 Hoechst 33258、Hoechst 33342 和 Hoechst 34580 是具有向 A-T 富集區(qū)域插入趨勢(shì)的雙苯并亞胺。與 DAPI 類似，它們被紫外光激發(fā)并在 455 nm 處具有最大發(fā)射，在未結(jié)合條件下移動(dòng)到 510–540 nm。 Hoechst 染料還具有細(xì)胞滲透性，因此可用于固定細(xì)胞和活細(xì)胞。它們的毒性低于 DAPI。
不透膜的 DNA 染色劑是碘化丙啶，通常用于區(qū)分細(xì)胞培養(yǎng)物中的活細(xì)胞和死細(xì)胞，因?yàn)樗荒苓M(jìn)入??完整細(xì)胞。碘化丙啶也是一種嵌入劑，但對(duì)不同的堿基沒有結(jié)合偏好。在核酸結(jié)合狀態(tài)下，其最大激發(fā)波長(zhǎng)為 538 nm。最高發(fā)射波長(zhǎng)為 617 nm。未結(jié)合的碘化丙啶激發(fā)和發(fā)射最大值移動(dòng)到較低的波長(zhǎng)和較低的強(qiáng)度。它還可以在不改變其熒光特性的情況下與 RNA 結(jié)合。為了區(qū)分 DNA 和 RNA，有必要使用足夠的核酸酶。
一種無需事先操作即可在 DNA 和 RNA 之間產(chǎn)生差異的染料是吖啶橙。它的最大激發(fā)/發(fā)射對(duì)在 DNA 結(jié)合狀態(tài)下為 502 nm/525 nm，在 RNA 結(jié)合狀態(tài)下變?yōu)?460 nm/650 nm。此外，它可以進(jìn)入酸性區(qū)室，如陽離子染料質(zhì)子化的溶酶體。在這種酸性環(huán)境中，吖啶橙被藍(lán)色光譜中的光激發(fā)，而橙色區(qū)域的發(fā)射最強(qiáng)。它通常用于識(shí)別凋亡細(xì)胞，因?yàn)樗鼈冇泻芏啾煌淌傻乃嵝愿糸g

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區(qū)室和細(xì)胞器特異性染料
有許多特定的染料可用于研究細(xì)胞區(qū)室，例如溶酶體、內(nèi)體或細(xì)胞器，例如線粒體。
一種眾所周知的觀察線粒體的方法是使用 MitoTracker®。這是一種細(xì)胞滲透性染料，具有溫和的硫醇反應(yīng)性氯甲基部分，用于通過與半胱氨酸殘基的游離硫醇基團(tuán)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合基質(zhì)蛋白。 MitoTracker® 以不同的顏色和修飾形式存在（見表 1）。與羅丹明 123 或四甲基玫瑰胺等常規(guī)線粒體特異性染色劑相比，MitoTracker® 在用固定劑破壞膜電位后不會(huì)被洗掉。
LysoTracker 是一組不同顏色的染料，用于染色溶酶體等酸性隔室。這些是與熒光團(tuán)連接的可滲透膜的弱堿基。由于質(zhì)子化，這些堿很可能對(duì)酸性區(qū)室具有親和力（見表 1）。
與溶酶體相當(dāng)?shù)母羰沂轻劸平湍傅日婢械囊号荨＿@種膜封閉空間也是酸性的。在熒光顯微鏡中觀察它的一種方法是使用苯乙烯基染料，如 FM 4-64® 或 FM 5-95®。
在研究蛋白質(zhì)分泌時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 通常會(huì)被染色。一種經(jīng)典的染色該隔室的染料是 DiOC6(3)，它對(duì) ER 有偏好，但仍與線粒體等其他膜結(jié)合。另一種專門染色 ER 的方法是使用 ER-Tracker，例如 ER-Tracker Green 和 ER-Tracker Red。兩者都是基于 BODIPY 的染料，它們與格列本脲（一種磺酰脲酶）相連，它與僅駐留在 ER 膜中的 ATP 敏感鉀通道結(jié)合。 BODIPY（硼-二吡咯亞甲基）描述了一組幾乎不溶于水的相對(duì) pH 不敏感的染料。這使它們成為脂質(zhì)和膜標(biāo)記的非常好的工具。

4. 浦肯野細(xì)胞，小鼠小腦皮質(zhì)的三重標(biāo)記旁矢狀切面。 紅色：抗鈣結(jié)合蛋白-D28k/Cy3，綠色：抗 GFAP/Cy5，藍(lán)色：Hoechst 33258。
與 ER 相鄰的隔間 - 高爾基體 - 可以用熒光神經(jīng)酰胺類似物標(biāo)記，如 NBD C6-神經(jīng)酰胺和 BODIPY FL C5-神經(jīng)酰胺。 神經(jīng)酰胺是高爾基體中高度富集的鞘脂。
借助其他基于脂質(zhì)的染料，可以對(duì)特殊的膜區(qū)域（如脂質(zhì)筏）進(jìn)行染色。 這些富含膽固醇的結(jié)構(gòu)域可以通過使用 NBD-6 膽固醇或 NBP-12 膽固醇等（Avanti Polar Lipids）來可視化。
還可以借助對(duì)細(xì)胞中不同位置的偏好的蛋白質(zhì)對(duì)感興趣的區(qū)域進(jìn)行染色。 一個(gè)例子是使用小麥胚芽凝集素 (WGA)，它與質(zhì)膜中存在的唾液酸和 N-乙酰氨基葡糖特異性結(jié)合。

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離子成像
在神經(jīng)元研究、基因活動(dòng)或細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的情況下，研究細(xì)胞的離子濃度是有意義的。鈉、鈣、氯或鎂離子對(duì)許多不同的細(xì)胞事件有深遠(yuǎn)的影響。通常，離子可以在熒光標(biāo)記的螯合劑的幫助下被捕獲，這些螯合劑在與適當(dāng)?shù)碾x子結(jié)合時(shí)會(huì)改變它們的光譜特性。標(biāo)記螯合劑的一個(gè)例子是鈣指示劑 fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4 和 Calcium-Green。對(duì)于鈉檢測(cè)，通常使用 SBFI（鈉結(jié)合苯并呋喃間苯二甲酸酯）或鈉綠。 PBFI（鉀結(jié)合苯并呋喃間苯二甲酸酯）檢測(cè)鉀離子。

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功能分析
“功能測(cè)定”是一個(gè)廣義術(shù)語，用于涵蓋標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估可以用熒光標(biāo)記物可視化的各種功能。這些標(biāo)記可以包括但不限于任何上述標(biāo)記技術(shù)和熒光團(tuán)。對(duì)于許多這些功能性分析，染色試劑盒是市售的，可以很容易地應(yīng)用于各種各樣的樣品。功能測(cè)定的一個(gè)例子是眾所周知的和廣泛使用的活死測(cè)定。兩個(gè)熒光團(tuán)用于標(biāo)記活細(xì)胞和死細(xì)胞。掌握這兩個(gè)值，就可以評(píng)估細(xì)胞的整體健康狀況。將此信息與其他標(biāo)記相關(guān)聯(lián)甚至可以增加對(duì)基本過程的理解。

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熒光染料及其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)
下表顯示了熒光染料的完整列表及其各自的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)峰值。請(qǐng)注意，除了這些峰之外，每種染料都具有不同的激發(fā)和發(fā)射光譜。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中選擇幾種染料組合使用時(shí)，研究人員應(yīng)注意由于串?dāng)_（或滲漏）導(dǎo)致的重疊激發(fā)和發(fā)射光譜，這可能導(dǎo)致假陰性或陽性，或以其他方式模糊數(shù)據(jù)。另一個(gè)可以扭曲熒光成像的來源是細(xì)胞和組織中天然存在的熒光蛋白產(chǎn)生的自發(fā)熒光，這在植物或藻類的實(shí)驗(yàn)中尤其需要考慮。充分了解樣品中所用染料的光譜對(duì)于選擇合適的激發(fā)光源（例如 LED、弧光燈、激光線）以及合適的發(fā)??射濾光片和檢測(cè)器也很重要。

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6.Alexa 488（綠色曲線）和Alexa 555（黃色曲線）的熒光發(fā)射曲線。 兩個(gè)發(fā)射光譜的重疊是顯而易見的。 紅線表示 488 發(fā)射濾波器的帶通。

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表1-熒光染料

熒光染料產(chǎn)品	Excitation	Emission
Indo-1, Ca saturated	331 nm	404 nm
Indo-1 Ca2+	346 nm	404 nm
Cascade Blue BSA pH 7.0	401 nm	419 nm
Cascade Blue	398 nm	420 nm
LysoTracker Blue	373 nm	421 nm
Alexa 405	401 nm	421 nm
LysoSensor Blue pH 5.0	374 nm	424 nm
LysoSensor Blue	374 nm	424 nm
DyLight 405	399 nm	434 nm
DyLight 350	332 nm	435 nm
BFP (Blue Fluorescent Protein)	380 nm	439 nm
Alexa 350	343 nm	441 nm
7-Amino-4-methylcoumarin pH 7.0	346 nm	442 nm
Amino Coumarin	345 nm	442 nm
AMCA conjugate	347 nm	444 nm
Coumarin	360 nm	447 nm
7-Hydroxy-4-methylcoumarin	360 nm	447 nm
7-Hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0	361 nm	448 nm
6,8-Difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0	358 nm	450 nm
Hoechst 33342	352 nm	455 nm
Pacific Blue	404 nm	455 nm
Hoechst 33258	352 nm	455 nm
Hoechst 33258-DNA	352 nm	455 nm
Pacific Blue antibody conjugate pH 8.0	404 nm	455 nm
PO-PRO-1	434 nm	457 nm
PO-PRO-1-DNA	435 nm	457 nm
POPO-1	433 nm	457 nm
POPO-1-DNA	433 nm	458 nm
DAPI-DNA	359 nm	461 nm
DAPI	358 nm	463 nm
Marina Blue	362 nm	464 nm
SYTOX Blue-DNA	445 nm	470 nm
CFP (Cyan Fluorescent Protein)	434 nm	474 nm
eCFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein)	437 nm	476 nm
1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (1,8-ANS)	375 nm	479 nm
Indo-1, Ca free	346 nm	479 nm
1,8-ANS (1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid)	375 nm	480 nm
BO-PRO-1-DNA	462 nm	482 nm
BOPRO-1	462 nm	482 nm
BOBO-1-DNA	461 nm	484 nm
SYTO 45-DNA	451 nm	486 nm
evoglow-Pp1	448 nm	495 nm
evoglow-Bs1	448 nm	496 nm
evoglow-Bs2	448 nm	496 nm
Auramine O	431 nm	501 nm
DiO	487 nm	501 nm
LysoSensor Green pH 5.0	447 nm	502 nm
Cy 2	489 nm	503 nm
LysoSensor Green	447 nm	504 nm
Fura-2, high Ca	336 nm	504 nm
Fura-2 Ca2+sup>	336 nm	505 nm
SYTO 13-DNA	488 nm	506 nm
YO-PRO-1-DNA	491 nm	507 nm
YOYO-1-DNA	491 nm	509 nm
eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein)	488 nm	509 nm
LysoTracker Green	503 nm	509 nm
GFP聽(S65T)	489 nm	509 nm
BODIPY FL, MeOH	502 nm	511 nm
Sapphire	396 nm	511 nm
BODIPY FL conjugate	503 nm	512 nm
MitoTracker Green	490 nm	512 nm
MitoTracker Green FM, MeOH	490 nm	512 nm
Fluorescein 0.1 M NaOH	493 nm	513 nm
Calcein pH 9.0	494 nm	514 nm
Fluorescein pH 9.0	490 nm	514 nm
Calcein	493 nm	514 nm
Fura-2, no Ca	367 nm	515 nm
Fluo-4	494 nm	516 nm
FDA	495 nm	517 nm
DTAF	495 nm	517 nm
Fluorescein	495 nm	517 nm
Fluorescein antibody conjugate pH 8.0	493 nm	517 nm
CFDA	495 nm	517 nm
FITC	495 nm	517 nm
Alexa Fluor 488 hydrazide-water	493 nm	518 nm
DyLight 488	493 nm	518 nm
5-FAM pH 9.0	492 nm	518 nm
FITC聽antibody conjugate pH 8.0	495 nm	519 nm
Alexa 488	493 nm	520 nm
Rhodamine 110	497 nm	520 nm
Rhodamine 110 pH 7.0	497 nm	520 nm
Acridine Orange	431 nm	520 nm
Alexa Fluor 488 antibody conjugate pH 8.0	499 nm	520 nm
BCECF pH 5.5	485 nm	521 nm
PicoGreendsDNA quantitation reagent	502 nm	522 nm
SYBR Green I	498 nm	522 nm
Rhodaminen Green pH 7.0	497 nm	523 nm
CyQUANT GR-DNA	502 nm	523 nm
NeuroTrace 500/525, green fluorescent Nissl stain-RNA	497 nm	524 nm
DansylCadaverine	335 nm	524 nm
Rhodol Green antibody conjugate pH 8.0	499 nm	524 nm
Fluoro-Emerald	495 nm	524 nm
Nissl	497 nm	524 nm
Fluorescein dextran pH 8.0	501 nm	524 nm
Rhodamine Green	497 nm	524 nm
5-(and-6)-Carboxy-2', 7'-dichlorofluorescein pH 9.0	504 nm	525 nm
DansylCadaverine, MeOH	335 nm	526 nm
eYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein)	514 nm	526 nm
Oregon Green 488	498 nm	526 nm
Oregon Green 488 antibody conjugate pH 8.0	498 nm	526 nm
Fluo-3	506 nm	527 nm
BCECF pH 9.0	501 nm	527 nm
SBFI-Na+	336 nm	527 nm
Fluo-3 Ca2+	506 nm	527 nm
Rhodamine 123, MeOH	507 nm	529 nm
FlAsH	509 nm	529 nm
Calcium Green-1 Ca2+	506 nm	529 nm
Magnesium Green	507 nm	530 nm
DM-NERF pH 4.0	493 nm	530 nm
Calcium Green	506 nm	530 nm
Citrine	515 nm	530 nm
LysoSensor Yellow pH 9.0	335 nm	530 nm
TO-PRO-1-DNA	515 nm	531 nm
Magnesium Green Mg2+	507 nm	531 nm
Sodium Green Na+	507 nm	531 nm
TOTO-1-DNA	514 nm	531 nm
Oregon Green 514	512 nm	532 nm
Oregon Green 514 antibody conjugate pH 8.0	513 nm	533 nm
NBD-X	466 nm	534 nm
DM-NERF pH 7.0	509 nm	537 nm
NBD-X, MeOH	467 nm	538 nm
CI-NERF pH 6.0	513 nm	538 nm
Alexa 430	431 nm	540 nm
Alexa Fluor 430 antibody conjugate pH 7.2	431 nm	540 nm
CI-NERF pH 2.5	504 nm	541 nm
Lucifer Yellow, CH	428 nm	542 nm
LysoSensor Yellow pH 3.0	389 nm	542 nm
6-TET, SE pH 9.0	521 nm	542 nm
Eosin antibody conjugate pH 8.0	525 nm	546 nm
Eosin	524 nm	546 nm
6-Carboxyrhodamine 6G pH 7.0	526 nm	547 nm
6-Carboxyrhodamine 6G, hydrochloride	525 nm	547 nm
Bodipy R6G SE	528 nm	547 nm
BODIPY R6G, MeOH	528 nm	547 nm
6 JOE	520 nm	548 nm
Cascade Yellow antibody conjugate pH 8.0	399 nm	549 nm
Cascade Yellow	399 nm	549 nm
mBanana	540 nm	553 nm
Alexa Fluor 532 antibody conjugate pH 7.2	528 nm	553 nm
Alexa 532	528 nm	553 nm
Erythrosin-5-isothiocyanate pH 9.0	533 nm	554 nm
6-HEX, SE pH 9.0	534 nm	559 nm
mOrange	548 nm	562 nm
mHoneydew	478 nm	562 nm
Cy 3	549 nm	562 nm
Rhodamine B	543 nm	565 nm
DiI	551 nm	565 nm
5-TAMRA-MeOH	543 nm	567 nm
Alexa 555	553 nm	568 nm
Alexa Fluor 555 antibody conjugate pH 7.2	553 nm	568 nm
DyLight 549	555 nm	569 nm
BODIPY TMR-X, SE	544 nm	570 nm
BODIPY TMR-X, MeOH	544 nm	570 nm
PO-PRO-3-DNA	539 nm	571 nm
PO-PRO-3	539 nm	571 nm
Rhodamine	551 nm	573 nm
Bodipy TMR-X conjugate	544 nm	573 nm
POPO-3	533 nm	573 nm
Alexa 546	562 nm	573 nm
BODIPY TMR-X antibody conjugate pH 7.2	544 nm	573 nm
Calcium Orange Ca2+	549 nm	573 nm
TRITC	550 nm	573 nm
Calcium Orange	549 nm	574 nm
Rhodaminephalloidin pH 7.0	558 nm	575 nm
MitoTracker Orange	551 nm	575 nm
MitoTracker Orange, MeOH	551 nm	575 nm
Phycoerythrin	565 nm	575 nm
Magnesium Orange	550 nm	575 nm
R-Phycoerythrin pH 7.5	565 nm	576 nm
5-TAMRA pH 7.0	553 nm	576 nm
5-TAMRA	549 nm	577 nm
Rhod-2	552 nm	577 nm
FM 1-43	472 nm	578 nm
Rhod-2 Ca2+	553 nm	578 nm
Tetramethylrhodamine antibody conjugate pH 8.0	552 nm	578 nm
FM 1-43 lipid	473 nm	579 nm
LOLO-1-DNA	568 nm	580 nm
dTomato	554 nm	581 nm
DsRed	563 nm	581 nm
Dapoxyl (2-aminoethyl) sulfonamide	372 nm	582 nm
Tetramethylrhodamine dextran pH 7.0	555 nm	582 nm
Fluor-Ruby	554 nm	582 nm
Resorufin	571 nm	584 nm
Resorufin pH 9.0	571 nm	584 nm
mTangerine	568 nm	585 nm
LysoTracker Red	578 nm	589 nm
Lissaminerhodamine	572 nm	590 nm
Cy 3.5	578 nm	591 nm
Rhodamine Red-X antibody conjugate pH 8.0	573 nm	591 nm
Sulforhodamine 101, EtOH	578 nm	593 nm
JC-1 pH 8.2	593 nm	595 nm
JC-1	592 nm	595 nm
mStrawberry	575 nm	596 nm
MitoTracker Red	578 nm	599 nm
MitoTracker Red, MeOH	578 nm	599 nm
X-Rhod-1 Ca2+	580 nm	602 nm
Alexa Fluor 568 antibody conjugate pH 7.2	579 nm	603 nm
Alexa 568	576 nm	603 nm
5-ROX pH 7.0	578 nm	604 nm
5-ROX (5-Carboxy-X-rhodamine, triethylammonium salt)	578 nm	604 nm
BO-PRO-3-DNA	574 nm	604 nm
BOPRO-3	574 nm	604 nm
BOBO-3-DNA	570 nm	605 nm
Ethidium Bromide	524 nm	605 nm
ReAsH	597 nm	608 nm
Calcium Crimson	589 nm	608 nm
Calcium Crimson Ca2+	590 nm	608 nm
mRFP	585 nm	608 nm
mCherry	587 nm	610 nm
Texas Red-X antibody conjugate pH 7.2	596 nm	613 nm
HcRed	590 nm	614 nm
DyLight 594	592 nm	616 nm
Ethidium homodimer-1-DNA	528 nm	617 nm
Ethidiumhomodimer	528 nm	617 nm
Propidium Iodide	538 nm	617 nm
SYPRO Ruby	467 nm	618 nm
Propidium Iodide-DNA	538 nm	619 nm
Alexa 594	590 nm	619 nm
BODIPY TR-X, SE	588 nm	621 nm
BODIPY TR-X, MeOH	588 nm	621 nm
BODIPY TR-X phallacidin pH 7.0	590 nm	621 nm
Alexa Fluor 610 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2	567 nm	627 nm
YO-PRO-3-DNA	613 nm	629 nm
Di-8 ANEPPS	469 nm	630 nm
Di-8-ANEPPS-lipid	469 nm	631 nm
YOYO-3-DNA	612 nm	631 nm
Nile Red-lipid	553 nm	636 nm
Nile Red	559 nm	637 nm
DyLight 633	624 nm	646 nm
mPlum	587 nm	649 nm
TO-PRO-3-DNA	642 nm	657 nm
DDAO pH 9.0	648 nm	657 nm
Fura Red, high Ca	434 nm	659 nm
Allophycocyanin pH 7.5	651 nm	660 nm
APC (allophycocyanin)	650 nm	660 nm
Nile Blue, EtOH	631 nm	660 nm
TOTO-3-DNA	642 nm	661 nm
Cy 5	646 nm	664 nm
BODIPY 650/665-X, MeOH	646 nm	664 nm
Alexa Fluor 647 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2	569 nm	666 nm
DyLight 649	652 nm	668 nm
Alexa Fluor 647 antibody conjugate pH 7.2	653 nm	668 nm
Alexa 647	653 nm	669 nm
Fura Red Ca2+	435 nm	670 nm
Atto 647	644 nm	670 nm
Fura Red, low Ca	472 nm	673 nm
Carboxynaphthofluorescein pH 10.0	600 nm	674 nm
Alexa 660	664 nm	691 nm
Alexa Fluor 660 antibody conjugate pH 7.2	663 nm	691 nm
Cy 5.5	673 nm	692 nm
Alexa Fluor 680 antibody conjugate pH 7.2	679 nm	702 nm
Alexa 680	679 nm	703 nm
DyLight 680	678 nm	706 nm
Alexa Fluor 700 antibody conjugate pH 7.2	696 nm	719 nm
Alexa 700	696 nm	720 nm
FM 4-64, 2% CHAPS	506 nm	751 nm
FM 4-64	508 nm	751 nm

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